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足球反波胆系统技术

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PCR技术概述

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)的发明,是分子生物学发展过程中的一个里程碑。各种耐热反波胆聚合酶的使用,使PCR作为一个实用的技术,在生命科学研究中成为不可缺少的有力武器。 通过PCR,极微量的反波胆目的片断以指数扩增的形式大量复制,这使之前许多无法想象的研究工作能够顺利进行。许多改良或变异的PCR方法,可以使这项技术应用于复杂多样的实验中,获得完全不同的效果。

耐热反波胆聚合酶,是PCR中的核心成分。反波胆聚合酶以单链反波胆为模板,将脱氧单核苷酸逐个加到延伸的互补反波胆链3’-OH末端,使目的片断得以复制。Taq 反波胆聚合酶是最常用的PCR聚合酶,具有耐热、扩增效率高等特点。但该酶没有3’→5’外切酶活性,如果发生dNTP错误掺入,这种酶没有校正能力,因此用Taq酶进行PCR,产物中点突变较多。由于Taq 反波胆聚合酶活性高,在热循环启动前就开始催化引物延伸,可能导致非特异性扩增。为提高PCR扩增的特异性,有时需要进行“热启动”,即在反应体系升温到变性温度后再加入Taq 酶启动反应;一些特殊形式的Taq 酶称为热启动酶,为可逆性失活的酶,可在反应前加入反应体系,但没有扩增活性,当反应体系升温到一定温度后,酶活性被激活,催化扩增反应。另一种常用的PCR聚合酶是Pfu 反波胆聚合酶,该酶有很高的3’→5’外切酶活性,校正能力极强,但PCR扩增效率较低。其它不同类型的耐热反波胆聚合酶还有Vent、rTth、UlTma等,以及Taq和Pfu的各种突变分子。

PCR体系中的镁离子浓度,是影响反波胆聚合酶效率的一个关键因素。过高的镁离子浓度会导致非特异性扩增产物产生,而过低的镁离子浓度则抑制扩增反应。 最适镁离子浓度还与反应体系中的其它成分有关,如dNTP浓度和引物浓度。

引物设计合成,是PCR扩增成功的关键因素。引物设计遵循的原则包括引物长度不少于16个核苷酸,而最高可达36个核苷酸以上,最佳长度为20~30个核苷酸;引物的GC含量和组成应均匀,尽量避免含有相同的碱基多聚体;引物内部应避免内部形成明显的二级结构,如发夹结构;引物之间不应发生互补,特别是在引物3’端形成互补结构;设计引物的Tm值不能过低。 计算机辅助引物设计是目前流行的方法,但不同软件的设计原则不尽相同,甚至Tm值的计算方法也大不相同,应留意所用软件的使用说明,正确使用。有时因扩增片断的特别需要,引物设计的选择余地很少,只能在引物长度上仔细比较选择。

现行的热循环仪一般都具有良好的升降温效率和热传导功能,热盖设计也避免了液体蒸发对PCR的影响。配合薄壁PCR管的使用,热循环时间比早期大大缩短。在PCR自动热循环设置中,最关键的因素是退火温度。通常将退火温度设置在引物Tm值低5℃左右的范围;提高退火温度可减少非特异性扩增产物,而降低退火温度可增加扩增产物的产量。PCR的指数扩增并非无限的,一般在25~30个循环后,扩增产物的量逐渐进入平台期。

本公司生产PCR技术相关的系列产品,包括各种用途的耐热反波胆聚合酶和试剂盒,为实验室PCR工作提供帮助。